Пензенская Духовная семинария была открыта 16 июня 1800 года. Ее открытию предшествовало то обстоятельство, что 16 октября 1799 года была открыта самостоятельная епархия Саратовская и Пензенская с пребыванием епископа в городе Пензе. Поэтому возник вопрос о создании духовного учебного заведения для подготовки кадров по обслуживанию нужд епархии. Таким заведением явилась Духовная семинария. Она готовила духовных лиц и учителей преимущественно народных школ.
Пензенская семинария была открыта в одном из старейших зданий города — бывшей усадьбе вице-губернатора на улице Троицкой. Занятия начались 6 ноября 1800 года. Первый контингент учащихся состоял из воспитанников других семинарий (преимущественно Астраханской). Служебный персонал был сформирован в основном из бывших воспитанников Астраханской семинарии. Первоначально семинария находилась в ведении Пензенского епископа и Пензенской Духовной консистории. Семинария состояла из четырех общеобразовательных и и двух специальных богословских классов. Предметы разделялись на главные и второстепенные. По главным предметам классы делились на низшие, средние и высшие, а также был приготовительный класс. В низших классах обучали славянскому и русскому языкам (чтению письму), русской грамматике и Закон Божий. Большое внимание уделяли изучению латинского языка, т. к. в последних классах обучение велось на латинском (на нем были изданы учебники). В высших классах изучались риторика, философия, богословие, греческий, французский и еврейский языки, катихизис, математика, геометрия, церковная и гражданская история. Были попытки введения курса медицины.
Первоначально в семинарии не было единого устава, учебных программ, не хватало преподавателей, учебные курсы разрабатывались по личному усмотрению преподавателей. Первые два года семинария оставалась без ректора, управление было временно поручено префекту. Первый устав ПДС был разработан в 1808 году.
В 1818 году произошло преобразование ПДС по уставу 1814 года, выработанного Комиссией духовных училищ. Низшие классы были выделены в особые учебные заведения — уездные и приходские училища, подчиненные семинарии. Духовная семинария перестает быть архиерейской школой, становится общеобразовательным учебным заведением. Консистория была полностью отстранена от участия в делах семинарии, последней предоставлялось право выбирать собственное правление., которое находилось в ведении Московского академического управления, а с 1843 года (открытие Казанской Академия) — Казанского академического управления. Во главе всего духовного образования находился один центральный орган: Комиссия духовных училищ. Местный епископ был главным попечителем духовно-учебных заведений.
Реформа 1818 года внесла изменения и в учебную часть: предметы семинарского курса остались прежние, но они получили одинаково важное значение и обязательную силу. Комиссией духовных училищ были выработаны учебные программы, был расширен курс учебных предметов. Новый устав требовал, чтобы все преподаватели были с высшим образованием. Хотя низшие классы были выделены в особые учебные заведения, они помещались по-прежнему в семинарских зданиях. Здесь же проживали казенные ученики и некоторые преподаватели. Многие ученики за недостатком места жили на квартирах. Здание семинарии стало тесным. Поэтому была куплена усадьба на Дворянской улице, куда перевели низшие классы. А после пожара 1858 года здание семинарии было реставрировано и были сделаны пристройки.
В 1835 году обер-прокурором Синода упраздняется Комиссия духовных училищ, вместо нее создается Духовно-учебное управление при Синоде. Были введены новые богословские предметы, а также преподавание медицины, сельского хозяйства, геодезии, пчеловодства и др. Эта система существовала до 1867 года, а в ПДС классы медицины и сельского хозяйства были закрыты еще в 1865 году. Вместо них ввели преподавание педагогики и учение о местом церковном расколе.
В 1858 году в семинарии была открыта библиотека на добровольные пожертвования учеников.
С 1868 года семинарией стал издаваться местный орган печати — газета«Епархиальные ведомости« с двумя отделами: официальным и неофициальным (издавалась до 1917 года включительно).
14 мая 1867 года был учрежден новый устав духовно-учебных заведений, особенностью которого было то, что семинарии были поставлены в тесную связь с епархиальной властью и местным духовенством. Во главе управления был поставлен Духовно-учебный комитет, утвержденный вместо Духовно-учебного управления.
Семинарии их трехклассных преобразованы в шестиклассные. Были устроены специальные школы, где семинаристы старших классов могли упражняться в преподавании.
С 1895 года вводятся занятия музыкой и живописью.
В 1891 году было учреждено общество помощи нуждающимся воспитанникам семинарии на средства, пожертвованные с этой целью почетным блюстителем семинарии Е.П. Нероновым.
В 1900 году семинария отмечала 100-летний юбилей. К этому событию был написан исторический очерк о семинарии бывшим воспитанником, а затем преподавателем семинарии Троицким А.И. под названием «Пензенская Духовная семинария за истекший столетний период ее существования (1800-1900 г.г.)»
